本研究根据结果得出，醋酸盐可能在饮酒引起的肠道微生物群改变中发挥关键作用，并建议后续研究探索酒精和GTA修饰的微生物组对未接受过治疗的小鼠的影响在大多数情况下要了解酒精治疗本身对肠道微生物组的特定功能后果。

  长期饮酒导致的肝损伤是最常见的肝脏疾病之一。饮酒频率是影响微生物群变化的一个重要因素。本研究使用同位素标记的[1-13C]乙醇、宏基因组学和宏转录组学在乙醇喂养和灌胃小鼠模型中研究酒精摄入对肠道微生物群代谢的影响。首先，结果表明虽然稳定同位素标记的[1-13C]乙醇有助于小鼠肝脏、血浆和盲肠内容物中的脂肪酸池，但没有证据表明在厌氧条件下离体肠道微生物群进行乙醇代谢。接下来，我们通过宏转录组学观察到，肠道微生物群通过激活乙酸异化来响应乙醇喂养，而不是通过直接代谢乙醇。血液乙酸盐浓度在酒精消费期间升高。最后，通过补充三乙酸甘油酯增加全身乙酸水平，我们没有观察到对肝脏疾病的任何影响，但确实会引起与小鼠长期乙醇喂养相似的肠道菌群改变。本研究结果表明，乙醇不直接被肠道微生物群代谢，与乙醇相关的肠道微生物群变化是醋酸盐水平升高的副作用。这些醋酸盐效应的去趋势化可能对于理解导致酒精相关肝病的肠道微生物群变化至关重要。

  为了研究乙醇代谢和追踪乙醇的命运，我们通过口服管饲法向小鼠施用稳定同位素标记的[1-13C]乙醇。利用同位素光谱分析分析从血浆、肝脏和盲肠内容物中分离的棕榈酸盐的同位素富集情况(图1a)。乙醇对乙酸和乙酰辅酶A池有贡献，在血浆、肝脏和盲肠中由乙醇产生的新合成脂肪酸中脂肪碳分别高达27%、24%和18%(图1b)。此外，我们研究了[1-13C]乙醇对肝脏中TCA循环中间产物的贡献，包括柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸。我们发现这些极性代谢物在肝脏样本中仅略微富集(3-6%)(图1c)。此外，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂ND646将血浆、肝脏和盲肠中的棕榈酸合成降低至约0.5%(补充图1)。这些结果表明，口服给药[1-13C]乙醇有助于形成乙酸和乙酰辅酶A池，且主要用于脂质从头合成。

  a棕榈酸酯(C16:0)标记[1-13C]乙醇(y轴)，Mn代表棕榈酸酯(C16:0)质量同位素分布(MID)中的第n个同位素，最丰富的脂肪酸(x-轴)。b[1-13C]乙醇(N = 3)中的脂肪生成乙酰辅酶A标记。c[1-13C]乙醇(N = 3)的TCA循环中间产物标记。Cit，柠檬酸；αKG，α-酮戊二酸；Suc，琥珀酸；Fum，富马酸；Mal，苹果酸。条形图表示平均值，误差条表示标准误差。源数据作为源数据文件提供。

  2、乙醇不直接被肠道菌群代谢为了探索肠道微生物群是否可以直接代谢乙醇并有助于乙酸盐池，我们将灌胃或不灌胃乙醇(N = 6)的小鼠盲肠内容物分别置于含乙醇或葡萄糖(N = 12)的缺氧培养基中培养。虽然乙醇缺氧氧化为乙酸盐在热力学上是不利的(补充表1)，但我们推断，在盲肠内容物中存在其他有机物时，理论上可以共同代谢乙醇。我们发现乙醇对细胞没有毒性，因为我们观察到微生物密集生长，这可能是由于肠道内容物中存在残留的有机物(补充图2a)。然而，含有乙醇的培养物没有生长，并且在培养96小时期间乙醇未被消耗(补充图2b)。为了研究肠道微生物从乙醇中产生短链脂肪酸(SCFAs)的能力，我们在生长0小时和72小时后测定了8种常见的短链脂肪酸(乙酸、丁酸、己酸、庚酸、异丁酸、异戊酸、丙酸和戊酸)。在含有或没有乙醇的体外培养物中乙酸盐的产生没有显著差异。其他短链脂肪酸的浓度变化也没有显著差异(1μM)，这可能是由于肠道内容物中存在残留有机物(补充图2c)。以上结果表明，乙醇不能被体外肠道微生物群直接代谢为短链脂肪酸。

  3、乙醇喂养不会上调微生物乙醇脱氢酶接下来，我们评估了肠道微生物群是否可以直接代谢乙醇并为体内乙酸盐池做出贡献。我们通过对盲肠材料进行鸟枪宏基因组学和宏转录组学测序，研究了小鼠模型中肠道微生物群对口服给药乙醇的反应。共组装序列reads，基因组分箱(bin)，预测功能基因，生成丰度和转录表(参见方法)。乙醇喂养后，肠道微生物群发生了改变，如通过稳健主成分分析(RPCA)组成双图和Aitchison β-多样性距离对bin丰度(N = 14，置换多元方差分析(PERMANOVA)； Pseudo-F = 2.95, P = 0.003)和转录(N = 14, PERMANOVA；Pseudo-F = 2.47, P = 0.004)的聚类所示。乙醇喂养的小鼠和对照组小鼠通过拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)进行区分，如通过如下所述的宏基因组学获得的bin丰度(图2a左)和表达(图2a右)所示。在乙醇喂养的小鼠中，相对于肠球菌科(Enterococcaceae)，拟杆菌的丰度和总体表达水平增加，对数比均显著(图2b)。 在乙醇喂养的小鼠中，盲肠样本中微生物乙醇脱氢酶基因表达与rpoA管家基因的对数比没有显著改变(图2c)。接下来，我们探索了乙酸盐清除基因表达相对于rpoA管家基因的对数比。与对照组相比，乙醇喂养小鼠中的AMP乙酰辅酶A合成酶基因表达量显著上调，该基因与乙酸异化为乙酰辅酶A有关。然而，参与乙酸盐排泄的磷酰化酶和乙酸激酶基因表达的对数比没有显著改变(图2d)。这些结果表明，肠道微生物不是直接通过乙醇脱氢酶代谢乙醇，而是通过乙酸盐异化对乙醇喂养做出反应。与对照组相比，乙醇喂养小鼠的血清乙酸浓度显著增加(增加4倍)。先前已在人类受试者中观察到在饮酒期间由于肝脏中分解的乙醇导致血清醋酸盐增加。血清样本中其他SCFAs(丁酸、己酸、庚酸、异丁酸、异戊酸、丙酸和戊酸)未发生显著变化(图2e)。 在乙醇喂养小鼠中，乙醛脱氢酶基因表达相对于rpoA管家基因的对数比也增加(图2c)。这表明，由乙醇转化而来的乙醛被肠道微生物群进一步氧化为乙酸。乙酸到乙酰辅酶A的基因仅在拟杆菌门的bins中检测到(补充表2)。与微生物乙醛脱氢酶和AMP乙酰辅酶A合成酶基因表达上调相一致，在乙醇喂养的小鼠中，糖异生也被拟杆菌门bins上调(图3)。与乙醇类似，外源性乙酸盐的厌氧代谢在热力学上并不是单独有利的，而是通过肠道微生物组中常见的共代谢可行的。许多具有代谢乙酸盐所需基因转录的分箱(bin.135、bin.480、bin.412)属于拟杆菌纲，特别是拟杆菌属中的bin.135，其先前已被表征为在饮酒期间富集(补充图3，补充表2)。据此推测拟杆菌物种(Bacteroidesspp.)可能利用外源乙酸与有机物共代谢。为了确定测试的组合，我们使用脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的基因组尺度代谢模型(GEM)，该模型预测了在蛋氨酸或甘油存在下乙酸盐的共代谢(参见方法)。为了验证这一假设，我们在有或没有乙酸盐、甘油、蛋氨酸或葡萄糖的情况下，在梭菌基础培养基中厌氧培养脆弱拟杆菌。我们观察到，在添加甘油和乙酸盐的情况下，生长与单独葡萄糖的生长相似，但与单独添加乙酸盐和/或蛋氨酸不同。这表明，拟杆菌属物种可能在源自肝脏中乙醇转化为乙酸盐的肠道中外源性乙酸池的代谢中发挥作用，这为其随着酒精消耗而增加的丰度提供了一种可能的解释。

  图2 与对照组(蓝色)相比，在乙醇喂养小鼠(红色)中，乙酸清除和拟杆菌菌株上调，而乙醇脱氢作用没有改变。

  aAitchison距离在不同条件下的bin丰度(左)和表达(右)的组成双图，箭头用门水平分类着色。b在biplot中鉴定的拟杆菌门(Bacteroidetes)和肠球菌科(Enterococcaceae)菌株的对数比(y轴)用于比较处理组之间的bin丰度(左)和表达(右)(x轴)。c处理之间的微生物乙醇脱氢酶(左)和乙醛脱氢酶(右)对数比比较(x轴)。d各处理(x轴)之间比较的异化(左)或排泄(右)对数比(y轴)的乙酸盐转换。乙醇喂养(x轴)后的血清短链脂肪酸(SCFAs) (y轴)分别为乙酸(e)、丁酸(e左上)、丙酸(e左下)、异戊酸(e右上)和戊酸(e右下)。箱线图表示最小、最大、中值、第一和第三四分位数值(阴影区域)。通过双侧Wilcoxon秩和检验评估显著性，图中显示了Tukey HSD事后检验校正后小于0.05的p值(N=14)。

  图3 肝内乙醇转化的乙酸和乙醛被拟杆菌转化为乙酰辅酶A用于糖异生。(左)乙醇转化为乙酸(肝脏；红色)和乙酸/乙醛转化为乙酰辅酶A(拟杆菌门物种；蓝色)的途径。(右)涉及乙酰辅酶A排泄或异化的途径的表达(颜色条)和丰度(点大小)。与对照组相比，乙醇处理的糖异生途径(粗体)上调。

  4、乙酸模拟乙醇喂养引起的肠道菌群变化为了验证这些观察结果，我们对小鼠进行了灌胃乙醇喂养模型，并补充GTA (1.0 g/kg体重)或甘油作为对照，并与饲喂葡萄糖而不是乙醇(加/减GTA补充)的小鼠进行比较(N = 29)。GTA剂量是通过先前的实验确定的，其中GTA水平在低剂量(0.1 g/kg体重)、中剂量(1.0 g/kg体重)和高剂量(6.0 g/kg体重)下随时间变化(N = 4)。由于血液中乙酸水平存在显著差异，因此为较大的实验选择了中等剂量(补充图5)。在随后的更大型实验(N = 29)中，与葡萄糖-甘油组中的小鼠相比，乙醇-甘油、乙醇-GTA、和葡萄糖-GTA处理组的血液乙酸盐水平显着增加。在这些实验中，我们发现其他SCFAs没有显著变化。 没有乙醇时，在GTA处理组中未观察到肝损伤，如通过血清谷丙转氨酶(ALT)、肝脏甘油三酯(TG)水平和肝脂肪变性(图4b-d，补充图6)评估，这表明乙醇诱导的肝脏疾病并未因补充GTA而改变。通过鸟枪法宏基因组学和随后的Aitchison β多样性分析评估了微生物组的组成，只有葡萄糖喂养的无GTA小鼠与乙醇喂养的GTA小鼠之间的距离显著。这表明，血液中乙酸盐水平升高的小鼠(通过补充GTA实现)的微生物组与乙醇喂养组更相似(图4e)。在仅GTA(葡萄糖-GTA)处理组中观察到相对于肠球菌科的拟杆菌富集，类似于仅乙醇(乙醇-甘油)处理组(图4f)。 血浆乙醇水平(补充图6A)、肝脏乙醇脱氢酶(Adh)活性(补充图6B)和Cyp2e1蛋白表达(补充图6C，补充图7)表明，GTA处理的乙醇喂养小鼠中乙醇的吸收和肝脏代谢没有显著改变。通过粪便白蛋白水平评估，与甘油处理的长期乙醇喂养小鼠相比，GTA处理不影响肠道通透性(补充图6D)。综上所述，单独增加血液乙酸水平引起的盲肠微生物群变化与长期乙醇喂养引起的变化相似。在没有乙醇的情况下，乙酸相关的肠道微生物群变化不足以诱发肝脏疾病。

  图4 使用或不使用乙醇处理三乙酸甘油酯(GTA)会人为地增加血液乙酸水平，并模拟仅用乙醇处理时观察到的微生物变化，但不会损害肝脏。

  a全血短链脂肪酸(SCFA)测定，b血清谷丙转氨酶(ALT)测定，c肝甘油三酯(TG)肝损伤测定，d小鼠连续灌胃乙醇或葡萄糖有或无GTA喂养模型的经苏木精和伊红染色的肝脏代表性切片(N = 4)。比例尺，100 μM。e比较处理组与乙醇-GTA处理组的β多样性距离。p值由处理组之间的成对PERMANOVA确定。f各处理间(x轴)拟杆菌属和肠球菌科的对数比(y轴)。箱线图表示最小、最大、中值、第一和第三四分位数值(阴影区域)。通过双侧Wilcoxon秩和检验评估显著性，图中显示了Tukey HSD事后检验校正后小于0.05的p值(N=29)。

  酒精性肝病(ALD)与肠道微生物群的深刻变化有关，包括拟杆菌和肠球菌的改变。然而，拟杆菌(Bacteroidetes)和肠球菌科(Enterococcaceae)丰度的变化与许多其他宿主表型有关，而乙醇改变微生物组成的机制尚不清楚。使用宏转录组学，我们发现乙醇喂养后微生物乙醇脱氢没有显著改变，但AMP乙酰辅酶A合成酶基因表达上调。这一有趣的发现表明，微生物乙醇代谢对观察到的肠道微生物群变化没有显著贡献，这些变化可能是通过乙酸盐诱导的。因此，我们通过小鼠灌胃乙醇模型，补充GTA来验证我们的假设。我们发现补充GTA增加了血液乙酸水平，模拟了乙醇喂养观察到的肠道微生物群变化，但在没有乙醇的情况下没有引起肝损伤。这些结果表明，在没有酒精的情况下，乙酸盐诱导的肠道菌群改变不足以引起肝损伤。补充乙酸也不能保护肝脏免受乙醇诱导的肝损伤，尽管补充另一种短链脂肪酸丁酸盐确实降低了乙醇诱导的肝损伤(图5)。

  a实验一使用标记乙醇灌胃，以评估其代谢的位置。由此，我们发现乙醇在肝脏中被分解为乙酸盐，然后释放到循环中，并在肠道中形成更多的池。b实验二分两个阶段进行。首先，小鼠喂食Lieber DeCarli饲料共9周，之后比较不同条件下血液短链脂肪酸(SCFA)以及盲肠微生物群的丰度和转录。其次，收集盲肠微生物群并在含或不含乙醇的基本培养基中厌氧生长。这些实验表明，厌氧肠道细菌，特别是拟杆菌门的物种，不会将乙醇分解成乙酸盐，而是利用肝脏产生的乙酸进行糖异生。c通过灌胃三乙酸甘油酯(GTA)，在灌胃乙醇期间，肠道中发现了三个重复的乙酸水平，这会增加肠道乙酸水平，但不会增加血液乙酸水平。为了比较，进行了四种条件，即葡萄糖vs.乙醇和甘油vs.GTA的组合。测定肠道菌群丰度、肝损伤、血液短链脂肪酸和肠道乙酸水平。该实验证明，GTA引起的肠道微生物群变化与乙醇相似，增加了拟杆菌，但没有造成肝损伤。 虽然在人体中发现了产生高乙醇的细菌，但人体中是否存在酒精代谢菌株尚不清楚。在以无菌和常规速率急性施用乙醇后，无菌小鼠的直肠和盲肠中的乙醛浓度显著低于常规动物，这与两个肠道位置的细菌数量相平行，表明乙醛可能由细菌乙醇氧化产生。然而，我们的研究没有证据表明肠道微生物可以直接代谢乙醇，正如体外和体内实验所证明的那样。体外未检测到显著的乙醇消耗。小鼠喂食乙醇后，微生物乙醇脱氢酶基因表达未上调。相反，与对照组相比，在乙醇喂养的小鼠中，与乙酸异化有关的微生物基因AMP乙酰辅酶A合成酶的相对表达显著上调。

  本研究证明，由乙酸盐(而非乙醇)改变的肠道微生物群不会在肝损伤中发挥作用。常规小鼠表现出相对轻微的肝病。用严重酒精性肝病患者的粪便进行微生物群移植后，微生物群人源化小鼠乙醇诱导的肝病的严重程度增加。病原菌和病原体中的毒力因子是微生物群人源化小鼠和患者肝脏疾病的重要决定因素，它们可能独立于乙酸盐。此外，我们没有探索口腔微生物群在乙醇代谢中的可能作用，其中潜在的细菌群落成员已被证明可以在培养物中将乙醇代谢为乙醛。未来的研究将需要解决这些口腔微生物物种在体内的作用、胆汁酸的可能作用，并在更大的人群队列中复制这些发现。 乙酸代谢赋予多种代谢功能，例如能量产生、脂质合成和蛋白质乙酰化。当细胞耗尽产生乙酸的碳源并开始清除环境中的醋酸盐时，就会发生醋酸盐转换。已在人类中观察到酒精引起的醋酸盐血液水平升高。在本研究中，在灌胃和酒精性肝炎小鼠模型中，与对照组相比，乙醇喂养小鼠的血液乙酸水平显著增加。血清醋酸盐的增加可能导致肠道微生物群所在肠道中乙酸水平升高。为了适应有大量醋酸盐的新环境，肠道微生物群会输入并利用醋酸盐。将乙酸输入微生物细胞后，乙酸异化被激活，乙酸用于生产乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入TCA循环、糖异生、乙醛酸循环和从头脂肪酸生物合成。特别是，与对照组相比，酒精治疗组的糖异生上调。相比之下，与乙酸排泄有关的微生物基因表达(包括磷酰化酶和乙酸激酶)在乙醇喂养小鼠和对照组之间没有显著差异。这些结果表明，乙醇喂养激活了肠道微生物群中乙酸盐的异化过程。 综上所述，本研究表明，乙醇不直接被肠道微生物群代谢。肠道微生物群通过乙酸异化对乙醇喂养做出反应，而GTA补充模拟了与乙醇喂养相关的肠道微生物群变化。有趣的是，我们在小鼠体内发现的GTA和乙醇带来的变化之间的相似性表明，关注酒精消费的人类研究可能主要揭示了醋酸盐的影响，醋酸盐也可能来自许多其他饮食来源，特别是淀粉和/或微生物组及其代谢在个体之间的差异。旨在分离酒精对微生物组的有害影响或酒精诱导的微生物组变化的研究，必须仔细考虑这些因素，类似于众所周知的2型糖尿病的初始特征，最终证明是由于二甲双胍治疗导致的，需要在后续研究中仔细隔离变量。最近，酒精消费频率被认为是健康受试者和疾病患者之间微生物群差异的一个重要因素，并可能会混淆研究设计。综上，本研究结果表明，醋酸盐可能在饮酒引起的肠道微生物群改变中发挥关键作用，并建议后续研究探索酒精和GTA修饰的微生物组对未接受过治疗的小鼠的影响可能有必要了解酒精治疗本身对肠道微生物组的特定功能后果。